Flow cytometry(유세포 분석)란?
- 시료 내 세포를 분석(구별)하는 기술이다.
- 세포가 든 시료를 장비에 장착하면 장치가 시료를 빨아들이고, 시료 내 세포들은 얇고 가느다란 통로를 빠르게 지나간다.
- Vibrating system에 의해 세포는 하나씩 분리되고, 이 세포들이 지나갈 때마다 장치 내 레이저가 세포를 쏜다.
- 레이저가 지나가며 산란된 파장 정보가 detector에 감지된다.
- Flow cytometry 장비에 따라 초당 만개의 세포도 읽을 수 있으며, 30개 이상의 지표 분석이 가능하다.
측정가능한 대상엔 어떤 것들이 있는가?
- 단백질 발현(protein expression) : 세포 전체, 핵 내 존재하는 단백질의 발현
- 단백질의 전사후 변형(Protein post translational modifications) : 변형에 의해 일어나는 단백질의 잘린 형태 혹은 인산기가 붙은 상태(cleaved, phosphorylated proteins)
- 세포 상태(Cell health status) : 세포 생존율(viability), 세포 사멸(late-stage apoptosis or programmed cell death)
- Cell cycle status : G0/G1 phase, S phase, G2, 다중 염색체 상태(polyploidy)
- 조직이나 혈액 등 여러세포가 섞인 샘플(heterogeneous sample)의 세포 아형(subsets) 구분
FACS란?
- 세포 혼합물에서 특정 fluorescence(형광)이 표지된 세포를 detection(감지)하고 sorting(분류)하는 기술로, flow cytometry(유세포 분석) 기반의 방법이다.
- 여러 세포가 섞인 시료(heterogeneous mixture of biological cells)는 장비 내에서 ultrasonic nozzle vibrator를 지나가게 된다. 이 장비는 스프레이 노즐의 일종으로, 고주파의 진동이 piezoelectric transducer에 의해 생성되고 capillary wave(모세관파동)을 일으킨다. 파동의 진폭이 증가하다가 최대 높이에 도달하게 되면, 파동에 끝에서 작은 입자들이 떨어져나가 atomization(원자화)을 일으킨다. 그 결과, 시료 내 여러 세포들은 작은 입자에 포함된 하나의 세포(singlet) 를 포함한 방울이 되어 laser앞을 지나가고 detectors가 세포의 정보를 읽는다.
- Laser를 지난 세포는 형광 염료의 유무(항체 결합 여부)에 따라 전기장 시스템을 지나며 극성이 부여 받는다. 특정 항원이 있어 형광항체가 많이 붙은 세포는 음전하, 그렇지 않은 세포는 양전하를 띤다. 이후 전하의 차이에 의해 감지된 세포들은 같은 그룹끼리 모인다(항체가 있는가 없는가).
- 실험을 공부하는 과정에서 보니 세포를 분리하지 않더라도, 세포를 구분하고 분석하기 위해 유세포 분석기를 사용하는 실험은 대부분 FACS라고 불려지는 듯 하다.
Filter의 종류
- 원하는 세포를 확인하기 위해 FACS 장비 프로그램에서는 필터를 선택할 수 있다. 기본적인 산란광을 이용하는 FSC, SSC, 그리고 형광을 감지하는 다양한 필터들이다.
1. FSC (forward scatter)
- 직선으로 나아가는 빛을 감지하며 0~20도 사이의 위치에서 빛을 감지하고, 세포 크기를 의미한다.
*FSC-A (area), FSC-H (height), FSC-W (width)
- 세포가 너무 많거나 유속이 빠를 경우, 하나의 세포가 아닌 두개 이상의 세포(doublet)가 하나의 레이저에 감지될 수 있다. 이를 구분하기 위해 FSC, SSC로 세포 크기를 확인한 후 추가로 확인하는 지표이다.
- FSC-A 는 total signal area를 의미한다. 값이 클수록 뭉쳐있음을 보여주는 지표이다.
- FSC-H 는 signal's peak height 높이를 의미한다. Doublet은 이 값이 낮다.
- FSC-W는 pulse width를 측정하며, doublet일수록 값이 크다. FSC-W가 큰 것을 이용해 doublet을 제외할 수 있다.
- Siglet은 FSC-A, FSC-H를 각각의 축으로 뒀을 때 대각선에 위치하여 이를 통해 doublet을 제외할 수 있다.
2. SSC (side scatter)
- 세포 내 과립(granule)이나 핵에 의해 산란되는 빛을 측정한다. 90도 각도에서 감지되며 granularity에 따라 값이 다르다.
3. Filter
- 각 형광이 흡수하고 방출하는 범위의 빛에 따라 다른 것을 사용한다.
- 많이 사용되는 파장대와 염료는 다음과 같다.
실험의 예시 : Cell cycle analysis using Propidium Iodide
FACS를 공부한 이유는 세포 주기 분석을 위해서이다. 세포는 분열하는 과정에서 DNA의 양이 변화한다.
2N(G0/G1) -> ~N(S) -> 4N(G2/M)
그렇다면 다양한 주기의 세포가 가진 DNA를 염색한다면 ?
DNA의 양에 따라 세포가 어떤 세포주기에 위치하고 있는지 알 수 있다.
Propidium Iodide란?
- DNA와 RNA에 결합할 수 있는 형광 염료이다.
- Base pair 사이에 끼어 들어가 결합할 수 있다.
- 살아있는 세포는 온전한 세포막에 의해 염색되지 않는다. 이를 이용해 죽은 세포만 염색할 수도 있다.
- 죽은 세포 혹은 permeabilization 처리를 해준 샘플에 사용한다.
연습 실험 과정 요약
- 연습용으로 MCF7 세포주를 사용하였고, 70% ethanol -20도, overnight fixation 후 PI staining 및 FACS reading하였다.
- 세포 사이즈 확인을 위해 unstaining으로 확인한 결과 debris와 cell의 분포가 나뉨을 확인하였다.
- 이후 PI stain 샘플을 gating하여 장비 내 cell cycle 분석툴에 적용하였다.
- 세포가 위치한 분열 주기에 따라 세포별로 다르게 염색되어 분포가 구분되어 나타났다.
- 암세포를 사용한 다른 논문의 세포주기 실험과 비슷한 composition을 확인하였고, 추후 실험에 해당 프로토콜을 적용할 예정이다.
Reference
1. How a Flow Cytometer Works, ThermoFisher, https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/flow-cytometry-basics/flow-cytometry-fundamentals/how-flow-cytometer-works.html#:~:text=Introduction%20to%20flow%20cytometry,flow%20cytometry%20and%20microscopy%20techniques.
2. Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS), https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs
3. LearnHaem, https://www.learnhaem.com/courses/flow-cytometry/lessons/light-scatter/
4. Multi-angle pulse shape detection of scattered light in flow cytometry for label-free celll cycle classification, Daniel Kage et al., communications biology, https://www.nature.com/articles/s42003-021-02664-3#:~:text=The%20scattered%20light%20signals%20are%20commonly%20detected,the%20direction%20of%20the%20excitation%20laser%20beam.&text=Fluorescence%20and%20light%20scatter%20calibration%20allow%20comparisons,different%20flow%20cytometry%20platforms%20and%20detector%20settings.
5. AssayGenie, Flow Cytometry Gating: A comprehensive Guide, https://www.assaygenie.com/blog/flow-cytometry-gating-a-comprehensive-guide-07edab/?srsltid=AfmBOooHQnY4nz2LSnFieqZ8fDKApX4DSdrEqIAwHuoIZ_0FJCGQmPUm
6. Thermo Fisher, Optics of a Flow Cytometer, https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/flow-cytometry-basics/flow-cytometry-fundamentals/optics-flow-cytometer.html
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