LC-MS(Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry)란?
Chromatography 란?
- 시료를 분리하는 방법 중 하나이다.
- 혼합물과 이동상이 정지상을 넘어 이동할 때, 각자가 가진 친화성(affinity)에 따라 다른 상호작용이 일어나 이동속도가 달라지는 것을 이용하는 방법이다.
- 탄수화물, 단백질, 지질 대사물 등 다양한 물질의 분리에 사용된다.
Mobile phase (이동상) 이란?
- 액체나 기체로 이루어진 물질로, 정지상을 넘어 시료가 이동하도록 만들고 그 과정에서 혼합물 내 물질들의 분리가 일어난다.
- 이동상의 조성을 바꿔 이동 속도를 조절하고 효율적인 분리를 유도할 수 있다.
- 이동상은 analyte(피분석물)의 성질에 따라 isocratic(등용매), polar(극성), nonpolar(비극성) 물질이 될 수 있다.
Stationary phase (정지상) 이란?
- 피분석물이 분리과정에서 지나치는 물질이다.
- 고체, 액체, 기체 모두 될 수 있으며 polarity, affinity, size, charge에 따라 다양한 혼합물과 상호작용할 수 있다.
- 정지상과의 상호작용 정도에 따라 retention times(지나가면서 특정 물질들이 머무른 시간)과 elution profile(성분 분리 결과)이 달라진다.
LC(Liquid Chromatography, 액체 크로마토그래피)란?
- 이동상이 액체인 크로마토그래피를 말한다.
- 시료(액체)는 정지상(column)을 지나면서 시료를 이루는 물질에 따라 이동속도가 다르므로 시간이 지나면서 분리된다.
MS(Mass Spectrometry, 질량분석기)란?
- 시료 구성 성분들을 이온화한 뒤, 그 물질들을 진공 상태에서 질량 대 전하 비율 mass-to-charge ratios(m/z)과 각 이온의 intensity(강도)를 측정해 구성 성분을 검출한다.
- Mass spectrum은 m/z value에 따른 상대적인 이온 강도를 구분할 수 있으며, 일련의 mass spectrum(질량 범위)는 time point(시점)에 따라 생성된다.
- 즉, 물질의 질량에 따라 다른 이온 농도 수준을 가지게 되며 이를 이용해서 각 분자를 식별할 수 있다.
- 추가적으로 specificity(특이성)과 sensitivity(민감성)을 추가해 동시에 여러 성분을 분석할 수 있다.
LC-MS란?
- 액체 크로마토그래피의 정지상을 지나면서 시료는 성분 이동속도 차이에 따라 분리된다. 즉, 특정 시간에 어떤 물질이 위치하는지를 측정한다. (Retention time)
- 이후 시료는 이온화 과정을 거친 뒤 질량분석기로 들어간다.
- 질량 대 전하(m/z)를 측정해 물질을 검출한다. 즉, 어떤 물질이 질량에 따라 전하를 얼마나 가지고 있는지를 측정한다.
- 정량(얼마나 많이)적, 정성(어떤 것들이)적 분석이 가능한 분석 방법이다.
TMT(Tandem Mass Tag)란?
- Sample 각각에 chemical label reagent를 처리하고 여러 시료를 한 번에 분석하는 방법이다.
- 즉, sample에 각각 이름표를 달아주고 그 샘플을 합친 뒤 나눠서(fraction) LC-MS 분석을 하는 방법이다.
- 여러 샘플을 모아 분석하기 때문에 하나의 단백질 당 양이 증가하여 적은 양으로 인한 놓침을 줄여줘 더 정확한 분석이 가능하다.
- 위 그림을 통해 다시 한번 이해해보자면, 32개의 샘플에 각각의 이름표를 붙이고 샘플을 합쳐서 LC-MS 분석을 한다.
- 각 샘플은 한 번에 동일한 실험 과정을 거치므로 샘플 처리 과정에서의 차이가 줄어든다.
- 각 샘플이 가진 특정 단백질의 양을 비교할 수 있다.
LFQ 와의 차이점
1. Pooling
- 하나의 샘플을 한 번의 분석에 사용하는 것이 아니라 여러 개의 샘플을 합쳐서 분석해 샘플 간 분석 시 생길 수 있는 실험적 차이를 줄일 수 있다.
2. Low abundance protein 검출에 유리
- LFQ에서 하나의 샘플이 가진 A라는 단백질 양 1만큼 있다면 그 양이 적어 분석에서 놓칠 수 있다. 하지만 여러 개의 샘플이 pooling되면서 A라는 단백질이 10만큼 존재하게 되면 검출되어 LFQ보다 더 많은 단백질 검출이 가능해진다.
- 10이라는 단백질 내에 라벨링 차이로 각각의 샘플이 A라는 단백질이 얼마나 존재하는지 비교할 수 있다.
- 하나의 샘플에 특정 단백질이 적으면 검출 자체가 안되어 다른 샘플과 비교할 수 없지만, TMT에서는 검출된 단백질 내 비교가 가능해 더 깊이있는 비교 분석이 가능하다.
3. Normalization
- LFQ는 각 샘플의 분석 결과를 적절한 normalization방법을 이용한 후 비교 분석해야 한다. Chat GPT에 물어보니 단백질의 총 intensity를 기준으로 비교하는 방법이 가장 많이 사용된다고 한다.
- TMT는 분석 내 샘플간 상대적인 양의 비교 분석이 가능하다.
LFQ(Label free quantification) vs TMT labeling ?
| 특징 | LFQ | TMT |
| 분석 방법 | LC-MS | LC-MS |
| Labeling | X | O |
| 시료 처리 과정 | 각각의 샘플을 분석해야 해서 시간이 오래 걸림. | 한 번에 분석하지만 Tag labeling 하는 과정이 필요함. |
| Normalization | 모든 샘플 분석 이후 정량화 과정이 필수임 | 같은 MS 분석 내에서 정량함 |
| Sample수와 분석 횟수 | n개의 샘플만큼 n번 분석함. | multiplex수(한번에 분석 가능한 샘플 수)가 제한되어 있지만, 그걸 한번에 분석할 수 있음. |
| 1회 비용 | 상대적으로 저렴 | Labeling 과정 처리 과정 및 시약 비용 추가 |
| 처리량 | 낮음 | 높음 (deep proteomics) |
| 재현성 | 낮음 | 높음 |
Reference
1. Fundanmentals of LC, MS and LCMS, SHIMADZU, https://www.shimadzu.co.kr/service-support/technical-support/analysis-basics/fundamental/ms_and_lcms.html
2. StatPearls [Internet]. Chromatography, Sujatha MAhadevarao Premnath and Muhammad Zubair, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK599545/#:~:text=The%20stationary%20phase%20is%20a%20crucial%20component,on%20the%20polarity%2C%20affinity%2C%20size%2C%20and%20charge.
3. Thermo Fisher, Tandem Mass Tag (TMT) Systems, https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/protein-mass-spectrometry-analysis/protein-quantitation-mass-spectrometry/tandem-mass-tag-systems.html#:~:text=Tandem%20mass%20tags%20(TMT)%20are%20robust%20and,different%20samples%20using%20tandem%20mass%20spectrometry%20(MS).
4. Quantitative Proteomics to Label or not to Label, university of GUELPH, https://www.uoguelph.ca/aac/facilities/mass-spectrometry-facility/quantitative-proteomics/quantitative-proteomics-label-or-not
5. ChatGPT
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